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本文標題："老師對于原生質實驗材料前準備的指導"

老師對于原生質實驗材料前準備的指導：

準備時間：一小時

緩沖溶液的配製(0.625M的mannitol，500ml)

【注：藻類則為0.84M】

1.先在200ml的蒸餾水加入56.94g的mannitol，使其溶解后，再加蒸餾水直到總體積為500ml。

2.每一組先取10ml 的溶液到試管或燒杯中，或在實驗期間提供每一組學生取10ml的總量。

Notes：

1.甘露醣醇（mannitol）是一種六碳醣類之醣醇，幫助維持原生質體的等張滲透壓（isotonic），其百分比濃度約為12~14﹪。

2.以上所配製的mannitol溶液其pH值約為4~5，若將mannitol的pH值調為6~7時，將可獲得更多的原生質體。（一滴0.1N的NaOH應足夠調整50ml溶液的pH值）。

3.0.625M的蔗糖溶液可和煙草葉作用的很好，也可和Elodea及波菜葉作用。但蔗糖會被細胞代謝，所以在培養期間，其濃度會降低，而影響滲透壓緩沖的能力。

4.若製備原生質體的目的，是要來做電破法或其他的轉殖技術的，則用0.6M的mannitol，25mM的MES緩沖溶液。也就是加54.66g的mannitol和2.44g的MES 到200ml的蒸餾水中，用1.0N的NaOH（約每50ml，15滴）調整pH值到5.7，然后加水至500ml，滅菌。

5.MES是一種酸鹼緩沖物質（用來維持蛋白質活性）。

酵素：軟化酵素（macerase）和纖維酵素（cellulysin）

    * 用稱藥紙稱0.1g軟化酵素和0.2g纖維酵素，放入每組的試管中或燒杯中。P.S這兩種酵素可以溷合在一起。

    * 在用之前立刻加酵素到10ml的緩沖溶液內----酵素的濃度為1﹪軟化酵素和2﹪纖維酵素。

Note：

1.在用之前，立刻將酵素加入緩沖溶液中，因這些酵素長時間在高溫下會不穩定。如果是在無菌臺中操作下，可先用一個注射針筒，裝新鮮配好的酵素，用0.45μ的薄膜過濾消毒之。

2.Macerase (軟化酵素)是Sigma公司的專有名稱，也就是粗果膠酵素(crude pectinase)，是Rhizopus真菌萃取而來的。果膠酵素可將細胞與細胞之間軟化而分開。

3.Cellulysin是Sigma公司的專有名稱，也就是纖維酵素（cellulase），是從Trichoderma uride 分離而來的，此種酵素可溶解細胞壁的纖維素。

老師對于實驗大綱的陳述：（略）

下列的大綱將用轉殖的問題來當做活動的內容。

1.介紹轉殖的概念（外來DNA進入細胞的介紹）。討論為什么人要轉殖細胞的理由。（引入新的基因，而使新的性狀進入細胞或生物體內）。

2.要求學生描述細胞的屏障（如細胞膜、細胞壁）。討論藉由這些屏障而能維持在細胞內的物質（如水、溶質、胞器、DNA）和思考如果這些物質沒有在細胞內，細胞的命運將如何。討論為什么細胞可維持DNA在細胞內（膜可維持DNA在內，將可能同樣地會不讓DNA進入；假如病毒的DNA或RNA進入細胞內，通常會破壞細胞）。

3.引導學生思考出不傷害細胞的轉殖方法。并請學生詳述每個步驟的證明方法。

4.由學生來製備原生質體，并回答分析問題。

5.學生複習他們所提出的轉殖方法，并討論決定何者會成功。

外加的資訊：