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研究標本三維結構收集同焦平面水平的圖像
z軸的光切間距
為了研究標本的三維結構,要收集一系列不同焦平面水平的圖
像,相鄰焦平面的間距由向聚焦器發出的指令決定。確保重建圖像
在z、Y及z軸上的比例正確的最簡單辦法就是收集的光切面在2軸上
的間距與z、y軸上的像素值相同。但是,z軸上標本進行適當取樣
所需的焦平面間距應不小于z、Y軸上的像素值,原因在于縱向分辨
率比橫向分辨率差。最佳的焦平面間距(依據奈奎斯抽樣定理)為縱
向分辨率除以
更小的焦平面間距會導致取樣過多,光漂白的危險性隨之增加
。照明強度
照明強度逐漸提高到使熒光發射量達到飽和水平的過程中,熒
光發射量呈線性增長。照明強度剛好低于能使熒光發射量達到飽和
水平時,信號背景比與信噪比達到最佳。通過在光路中插入中密度
濾光片和/或使激光器在極限功率下工作來調節激光掃描
顯微鏡的
照明強度。一般來說,光漂白比例在可接受范圍內的情況下,照明
強度越高,得到的圖像越好。
共聚焦圖像的反差及信息量受光電倍增管(PMT)放大儀黑色電
平及增益的影響。為獲取最大信息量,
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