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本文標題："蔗糖梯度離心質體分離技術與電子顯微鏡觀察"
新聞來源：未知 發布時間：2012-12-11 23:16:53 本站主頁地址：http://www.pzfczx.com
植物生物技術與食品
第一節 植物組織培養與基因轉殖
植物體應處于一種具分裂能力且易于操作的狀態下，使轉殖基因能藉細胞分裂再分配到其他細胞中，因此首先必須瞭解植物的再生能力如何應用在組織培養及基因轉殖。
植物于幼年期或成熟期，于莖干頂端、莖葉交接處、根部尖端之分裂組織(meristem)、甚至葉片中，可進行光合作用之細胞依然保有分裂與分化之能力。
植物再生技術即以植物細胞之分裂與分化能力為基礎，配合含無機鹽類、維生素、醣類與植物激素之組織培養基來執行。
對植物基因轉殖工作而言，小塊的植物組織或去除細胞壁的原生質體易于轉殖實驗操作，且植物組織培養本身即有純化及量產的目標，故利用植物再生能力建立的組織培養是藉基因轉殖大量生產新種植物的重要基礎。
第二節 載體媒介基因轉殖技術
成功的基因轉殖必須先使外源DNA進入細胞中，且插入基因體內并穩定的進行表現產生RNA及蛋白質。良好的載體不但可以攜帶欲轉殖之DNA片段，還可使此DNA片段插入被轉殖宿主之基因體中，并且使外源DNA發揮功能。
帶有一個特殊質體的農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)已被證實可達成上述要求，因此這種會引起植物腫瘤的細菌經過質體修飾后，便成為目前最普遍使用的植物基因轉殖媒介。
農桿菌做為植物基因轉殖媒介之基礎研究
農桿菌基因轉殖
以含雙載體之農桿菌轉殖標的基因
基因轉殖效果之確認
農桿菌做為植物基因轉殖媒介之基礎研究
Ti質體
藉由蔗糖梯度離心質體分離技術與電子顯微鏡觀察，證實有一大型質體存在于農桿菌中。此一200~800 kb之大型質體因可引起腫瘤，故稱為Ti質體。
T-DNA
vir基因
T-DNA
農桿菌感染時僅轉移一部分Ti質體至植物細胞基因體中，后來被轉移之Ti質體片段被稱為T-DNA，T-DNA系Ti質體上之一段單股序列。
vir基因
除了T-DNA外，Ti質體上另有一組vir（virulence，即代表致病性）基因，也與農桿菌之植物致病性極有關聯。vir基因分為virA~H，virD基因所表現之virD蛋白負責辨識并切割T-DNA。
農桿菌基因轉殖
雙載體系統為目前在農桿菌植物基因轉殖時最常用的，此系統系將Ti質體進行剪裁修飾后獲得。
Ti質體載體
載體一同時帶有大腸菌與農桿菌之DNA複制起始點，大部分T-DNA區域已移除，只剩可被virD蛋白辨識之LB與RB序列，利用T-DNA移除區域接上標的基因與一篩選用之標識基因。載體二上之virD基因產生virD蛋白，切割LB與RB序列將其中所含之DNA轉殖入植物基因體中。
圖4-2 以Ti質體上之T-DNA 區域構筑標的與報導基因表現組之二例
基因轉殖效果之確認
基因轉殖后期工作為確認標的基因已穩定的插入植物基因體DNA內，并且外來基因可隨著生殖作用傳遞到子代中，在實驗上可抽取轉殖株之總體DNA (total DNA)，以根據標的基因序列設計之PCR引子偵測其中是否含有標的基因。當證實標的基因已插入植物基因體內后，還可利用免疫分析法配合蛋白質活性測試，檢測標的基因是否已表現出具有生物活性的蛋白質。
第三節 非載體媒介基因轉殖技術
微粒子撞擊轉殖法
電穿孔轉殖法
微粒子撞擊轉殖法
在轉殖技術上，標的基因也可以物理方式直接送入植物細胞中，而微粒子撞擊(microprojectile bombardment)或稱粒子槍是最常用來取代農桿菌轉殖法之直接轉殖法。
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