本文標題："了解溷濁度和活菌數目之間的關系"

溷濁度和活菌數的關系(Relationship between
Turbidity and Live bacteria)

目的：

1. 了解無菌操作的方式
2. 了解溷濁度和活菌數目之間的關系
3. 瞭解如何做稀釋

原理：

簡介大腸桿菌(Escherchia coli)

大腸桿菌的品系(strains)

E. coli B/r (HB101) wild type
E. coli TOP10F’ F’{lacIq, Tn10(TetR)} mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC) ψ80lacZ△M15
△lacX74 deoR recA1 araD139 △(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR)

菌種的純化( Strain purification)
1. Overnight culture (O/N) — 用接種環或藥匙經消毒后，從甘油儲存菌種或LB平板
上取出（沾一下）菌，接種于3-5 ml的LB（含有適當的氨基酸或是抗生素），在
37 ℃下震盪培養隔夜（14-18 小時）。
2. Dilution buffer — 滅菌過的100 mM MgSO4
3. Isolation of single colonies — 剛拿到手的菌種或是從甘油儲存菌種要開始作實驗
前，菌種需先純化﹕用單一菌落﹔得到單一菌落的方法有二﹕（1）從O/N culture 用

100 mM MgSO4去做一連續的十倍稀釋，用接種環從高稀釋度開始取出稀釋液，
涂抹在LB平板上﹔（2）用接種環沾取O/N culture或菌落涂抹在LB平板的一邊
（a），接種環經消毒后，再從第一次涂抹的地方把菌涂抹開，以便得到單一菌
落（b1-b4）。若是新到手的菌種，在得到單一菌落后，先根據基因型去測試菌

種。
4. 菌種保存﹕glycerol (10%) or DMSO (7%) storage (at –70 ℃)

測量細菌的濃度 (cells/ml)

用溷濁度﹑細菌數目和活菌數目來測定。
溷濁度 — 其原理是可將細菌視為懸浮顆粒，這些顆粒可阻斷光線的通過，因此

細菌濃度愈高，通過的光線愈少，就等于吸光值愈大，然而我們不認為它是吸
光值，只是細菌將光線散射掉了，因此我們用溷濁度表示﹔大多數時候我們是用
LB來培養E. coli，因為LB的顏色是黃色，所以用分光光度計去測量細菌濃度時，
波長選用600 nm﹔若是用minimal medium來培養E. coli，因為minimal medium的顏
色是無色，所以用分光光度計去測量細菌濃度時，波長選用460 nm。用溷濁度來

測量細菌的濃度只是估計值，正確數目則需用下列方法決定之。
細菌數目— 使用Petroff-Hauser Chamber在顯微鏡下數細菌的數目，在這
Chamber內約有100格，每格的體積為10 µl﹔在使用此Chamber需要將此玻片的兩面

清乾淨，尤其不能有任何的纖維殘留，因為纖維會將細菌和培養液分隔開而造成
菌數分配不均，進而影響精確度。蓋玻片是否確實蓋好也是影響精確度的重要因
子。
活菌數目— 上一項的方法將死和活的細菌數目均計算在內，所以活的細菌數目是
用一連續的稀釋菌液后，取0.1 ml的稀釋液涂抹在LB平板上等菌落長出后，數其
菌落數，即可推出每ml的活菌數目。

器材：

培養基(LB)
100 mM MgSO4溶液
37℃培養箱(incubator)

方法：

1. 向助教領取兩種（年輕和年老）的菌液，分別作1/2（年輕）和1/4（年老）的稀
釋，先用分光光度計以600 nm波長去測量稀釋液的溷濁度，并紀錄其值。
2. 用此數據1 OD600= 1-3 X 108 cells/ml去推算約略所需要的稀釋度，以便在取用0.1
ml的稀釋液去涂抹在LB平板時，可得到菌落數為30-300個。
3. 稀釋菌液用10 mM MgSO4溶液。
4. 稀釋后用三種連續稀釋度，如10-1﹑10-2和10-3，取兩次0.1 ml的稀釋液分別去涂抹
在LB平板（共6個LB平板），等到LB平板上所有的液體不見后，將平板倒置并
放置于37 ℃培養箱，次日中午以前到助教處數菌落數。

5. 請討論為何從年輕和年老的菌液所得的菌數有差異，和前面的實驗又有何關聯﹖
6. 請和實驗一的數據作比較，提出一個假說。用下星期的實驗數據來驗證。

殺過菌的玻管
細菌展開用的玻棒
培養基平板