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本文標(biāo)題："微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-繼代細(xì)胞培養(yǎng)（Vero cell）"

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-繼代細(xì)胞培養(yǎng)（Vero cell）

1. 觀察25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部細(xì)胞已長滿且培養(yǎng)液清澈無細(xì)菌污染之狀態(tài)。

2. 倒掉原有的培養(yǎng)液，以磷酸緩沖溶液（pH 7.2-7.4）清洗2～3次。

3. 加入約3 ml之0.05% Trypsin/EDTA消化液至T-25角瓶內(nèi)，將細(xì)胞充分覆蓋并

停留15-30秒。

4. 倒掉Trypsin/EDTA，置于37℃培養(yǎng)箱感作約1分鐘。

5. 以顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，若出現(xiàn)圓形化后輕拍細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，使細(xì)胞脫

離培養(yǎng)瓶底部表面。

4. 加入10 ml新的培養(yǎng)液，以塑膠吸管連接pipetman反覆吸放沖刷細(xì)胞培養(yǎng)角

瓶內(nèi)之細(xì)胞液，直到顯微鏡下未見大的細(xì)胞團(tuán)塊為止。

5. 以血球計(jì)算板計(jì)算細(xì)胞數(shù)，額外加入新的培養(yǎng)液，調(diào)整成5-10×104 cells/m

之細(xì)胞懸浮液。

6. 取新的25 cm2培養(yǎng)瓶上寫明細(xì)胞名稱，繼代數(shù)目、日期及細(xì)胞數(shù)目。

7. 將每培養(yǎng)瓶加入5 ml細(xì)胞懸浮液，旋開瓶蓋一圈。

8. 置入5% CO2 培養(yǎng)箱中于37℃下過夜培養(yǎng)。

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結(jié)果

1. 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶自 5% CO2 培養(yǎng)箱取出后栓緊瓶蓋，以肉眼觀察培養(yǎng)液的顏色、

瓶底細(xì)胞生長覆蓋之情形。

2. 于倒立顯微鏡下觀察并以繪圖方式紀(jì)錄細(xì)胞之型態(tài)與生長情形。

六、問題與討論

1. 株化細(xì)胞為何能以人工方法作不限次數(shù)之繼代培養(yǎng)而初代細(xì)胞不行？

2. 為何細(xì)胞培養(yǎng)液需額外添加胎牛血清？