本文標題："不知道在做DAB時， 最后在染核時，是用什么染劑?"

IHC的background消不掉
: 我用的是心臟組織，目前blocking的條件是1%的PBA于室溫下一小時，
: 而且另外在一抗前，還用一個comercial的power blocking reagent做blocking，
: 至于組織本身顏色的問題，心臟組織我目前染的感覺，在螢光顯微鏡下，
: 不同濾鏡片，也會呈現不同顏色，
: 至于在光學顯微鏡下，我到覺得沒啥顏色就是，
: biotin的問題，其實我不太懂，但是該做的步驟我都有，
: 像是H202的quench，這方面我不熟悉，所以我不知道會不會有什么影響

  做DAB呈色  用H2O2以去除內生性的proxidase是很重要的
  但是如果是做螢光染色  這各步驟可以省略

  還有  可以試試看用  H2O2的步驟  最后反應用螢光呈色
  再利用Roche的 Conver-POD 就可以針對 FITC的螢光在接合后
  用DAB呈色
  這各我以前也有玩過  至少一個片子  可以看到兩種效果
  (不過  只可針對用FITC的)

: 另外，antigen unmasking我是有做的，我是以10mM的sodium citrate，
: 以隔水加熱法，于沸水中作用20分鐘，
  Sodium citrate我習慣用 fresh的 (還得要調pH值)
  不過因為我都是做冷凍切片  這各步驟就不一定要做
: 不過冷卻的動作我倒是挺隨性，煮完我就直接泡在PBS了，不知道這樣會不會有影響
: 過染的問題，我比較好奇的是，各位前輩在做DAB染色時，
: 當加入DAB reagent后，都可以在30秒內，
: 整個組織切片，會用肉眼就可以看到明顯的變成紅褐色嗎？
: 因為我目前有這樣的狀況。
: 抱歉，敘述的不是很好，不知道在做DAB時， 最后在染核時，是用什么染劑，
: 以及染完后，是否整個組織顏色都會變成此染劑的背景色
: 謝謝各位喔  m(_ _)m

  有時候DAB染的過度  會造成很強的背景
  所以  當在做DAB反應的時候
  可以準備一臺顯微鏡  將確定會有反應的片子
  或是有做 postive control的片子
  滴上DAB反應劑  觀測看看  預期可能反應的細胞  或  組織
  是否有反應的細胞  終止反應就將片子放在TBS中(or PBS)
  通常我都是以觀察大約數片  之后決定所有片子的反應時間
  最短的  30秒都有可能  而且老師很挑剔的要看到
  背景乾乾淨淨  細胞反應很明顯的對比

  之后如果再做對比染色就相對的比較容易做出差異性的區別
  再退染時  我也都會用顯微鏡觀察
  是否有達到我要看到核有染上色 但細胞質沒有 (酒精退色的時候要注意看)
  最好是細胞核就深深的藍色  而細胞質是透明的

  雖然說起來很簡單  但是  我知道  會手忙腳亂
  因為我一開始常常就是把片子染DAB  老闆對著我說
  "妳的組織切片  是被妳用火燒過嗎?!"

  再來是對比染色時  老闆會說  妳是染細胞核還是整各細胞質啊?!

  此外  在不同組織塊  得要挑選適合的染劑作對比染色
  像 brain  用 Hematoxylin  很不容易染上色
  可換用 Nissl stain 會很明顯的看到neuron 的細胞核
  不過  大部分採用 Hematoxylin 即可

如果方便可以提供你是用哪種組織及blocking的條件,會比較      12/27
容易找問題,或許有些人有類似的經驗
background可能來自組織本身的biotin,此時就要從blocking著手
你的組織本身就有顏色嗎? 會不會是過染了?
如果是過染 把一抗的比例調低試試
你有做antigen unmasking嗎?