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本文標題："基因植入動物細胞最常用的方法?"
基因植入動物細胞技術
此處緊介紹最常用的方法, 并以組織培養之單層細胞為標的.
組織培養動物細胞, 應注意無菌技術, 為求初學者溶液著手, 以Hela細胞, 即可高溫高壓消毒的MEM培養液開始, 加入10﹪的牛血清. 并加入Gentamicin sulfate(抗生素), 以防污染. 在細胞剝離培養器時, 採用0.5﹪w/v的trypsin即0.2﹪w/v的EDTA液, 所有的培養液, 在使用前, 必須先抽出少量, 先在CO2恆溫培養相中培養至少2天, 無污染出現, 才能使用. 在從事基因植入動物細胞技術前, 應先熟悉動物組織培養, 即生長曲線為必要之練習. 每4小時, 由12圓隔培養盤中, 取出一隔之細胞計數, 至72小時為止. 藉此練習來熟悉無菌即培養技術.
以Calcium Phosphate沉淀DNA于HEPES緩沖液中并使DNA植入動物細胞法：
材 料：
生長期Hela細胞
培養液
質體DNA(含能在動物細胞中表現之可探測基因)(每次轉植需10~50μg DNA)
2.5M CaCl2
2x HEPES-buffered saline (Hebs)
[配方]16.4g NaCl
11.9g HEPES acid
0.21g Na2HPO4
800ml dH2O
以5N NaOH調整pH至7.05
以0.45μm濾膜過濾消毒, 分別用50ml量保存在-20℃
注意：此時必須將0.5ml之2xHeBS與0.5ml之250mM CaCl2溷合, 看有否沉淀發生, 如無很細的沉淀, 則效果不佳.
Phosphate-buffered saline (PBS)
[配方] 10X保存液配方：
80g NaCl
2g KCl
11.5g Na2HPO4 7H2O
2g KH2PO4
1X的使用液配方： (pH約為7.3)
137mM NaCl
2.7mM KCl
4.3mM Na2HPO4 7H2O
1.4mM KH2PO4
37℃, 5﹪CO2恆溫培養箱
10cm組織培養皿
15ml無菌conical tube
方 法：
1. 在轉植前一日, 將細胞接種入培養皿, 約1：15比率稀釋完全滿佈的細胞, 加入9ml培養液.
2. 將要轉值得DNA, 以酒精沉淀, 并晾乾, 再溶入450μl的無菌蒸餾水中, 再加入50μl之2.5M CaCl2. (此處以酒精沉淀DNA的目的在消毒)
3. 在一個15ml的conical tube中加入500μl的2X HeBS, 此時一面以一個無菌1μl吸管向此液中打氣, 一面一滴滴的加入DNA/CaCl液, 加完后立即votex 5秒鐘.
4. 置室溫20min.
5. 將此DNA沉淀液均勻分布在組織培養皿之細胞上.
6. 培養6小時, 倒去培養液, 以5ml之1X PBS洗細胞2次, 再加入10ml培養液.
7. 若為暫時性的轉植, 隔日即可取下檢測. 若為培養穩定之轉植細胞, 則令細胞長二次分裂的時間, 在保存之.
預期結果：約10﹪的細胞可被轉植.
附注：
為能偵測基因有否植入細胞, "可探測基因"如β-galactosidase, 或螢火蟲之luciferase基因均可使用.
在此之前, 本手冊層介紹將基因轉植入細菌的方法, 當時所使用的為快速簡易法, 但基因植入的成功率極低, 此外也已介紹CaCl2法, 在此一并將使用CaCl2來轉植細菌的方法列出, 供參考：
材 料：
LB培養液
E.Coli純菌
CaCl2液
[配方]60mM CaCl2
15﹪glyerol
10mM PIPES, pH7.0 (如無PIPES, 則取上二種材料配製)
可高溫高壓消毒.
LB培養皿含ampicillin
Plasmid DNA
方 法：
1. 將此菌E.Coli接種于50ml LB液中, 過夜37℃, (250rpm)振盪培養.
2. 取上述E.Coli 4ml, 加入有400ml LB液之1 liter錐瓶, 37℃, 250rpm, 培養6小時.
3. 將(2)中的E.Coli分裝在離心管中, 每支50ml, 并置冰上10min, 再離心5,000rpm, 5分鐘, 4℃.
4. 將細菌沉淀再溶于10ml, CaCl2液中, 再于4℃, 5,000rpm, 5min.
5. 再將細菌沉淀溶于10ml CaCl2液中, 置冰上30min, 再4℃, 離心5,000rpm, 5min.
6. 再將E.Coli溶于2ml CaCl2液中, 再分成250μl至微量離管中. 并保存在-70℃, 待用.
7. 取一支圓底離心管, 置冰上,加入10至25μl之plasmis DNA約10ng, 取出冷凍于-70℃的細菌, 快速在37℃解凍, 取出100μl加入含DNA的離心管中. 置冰上, 10min.
8. 將此離心管轉投入42℃水溶中, 2min, 加入1ml之LB液, 再放37℃, 250rpm, 1hr.
9. 將此轉植過的細菌, 稀釋數次, 每次以玻棒涂平盤法涂在恆溫培養箱, 至第二日檢視結果.