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本文標題："初級細胞的初代培養-顯微鏡下觀察神經細胞的型態"
濕度固定、空氣成分含百分之五之二氧化碳（5%CO2/95%
Air）培養箱。每兩天替換新鮮10％FBS之DMEM/F12，培養細胞至第九天進行實驗。
二、初級細胞的初代培養(Primarymixglialculture)
以麻醉劑pentobarbital將出生1天之鼠犧牲后，將其大腦
皮質組織置于內含penicillin-streptomycine、fungizone及
HBSS配置成的solutionD中，清除血管與殘馀軟腦膜后以機
械方式絞碎。將腦組織浸泡在細胞培養液及0.25%胰蛋白脢
消化液（Trypsin-EDTA）中，在37℃水浴槽靜置5分鐘待細
胞沉淀，去除上清液，加入含有10％FBS(FetalBovineSerum)
DMEMF-12培養液，離心(2000rpm)10分鐘。去除上清液，
加入新的細胞培養液并以電動吸管（Pipet）反覆吸放數次，
溷合均勻，以紗布過濾不要的組織塊。細胞懸浮液以血球計
數器計算細胞數，再分種于預先舖有poly-L-lysine（0.02g/L）
。
處理過的12孔細胞培養皿內（細胞數約為5×105cells/well）
細胞培養于37℃、濕度固定、空氣成分含百分之五之二氧化
碳（5%CO2/95%Air）培養箱。每兩天更換10％FBS之
DMEM/F12之培養液，培養9-12天取用細胞進行實驗。
貳、細胞免疫染色（Immunocytochemicalstaining）
透過細胞免疫化學染色法分別鑑定培養之神經細胞與溷
合膠質細胞，以glialfibrillaryacidicprotein（GFAP）之抗體
標示星狀膠質細胞，以微小管相關蛋白質-2（microtubule
associatedprotein-2，MAP-2）之抗體標示神經細胞，以OX-42
之抗體標示小神經膠細胞。藥物實驗后，給予4％福馬林固定
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二十分鐘，先將樣本以PBS清洗二次，目的為洗去固定液，
以0.4％TritonX-100與1％BSA溷和溶入PBS製成的Blocking
soluyion處理30分鐘，以PBS清洗后分別加入所需之一級抗
體（primaryantibody），包括
anti-MAP-2，存放于4℃反應24小時后以PBS清洗一次，使
用二級抗體（biotinylated
immunoglobulins）反應2小時以PBS清洗一次，加入ABC
solution反應30分鐘，以PBS清洗一次以DAB加5％H2O2
進行呈色反應，并于顯微鏡下觀察神經細胞的型態。
anti-GFAP、anti-OX-42、
anti-rabbit
and
anti-mouse
參、細胞傷亡測試
一、定性:
(1)藉由顯微鏡觀察細胞型態的變化，了解細胞受損的情
況。
(2)
A.原理：
Trypanblue會直接進入死細胞中而呈色，而活細胞膜完
整且具有選擇性通透性，染料無法滲入而不會呈色，由此
可得知細胞存活率，此法又稱色素排除法。
Trypanblue染色法:
B.步驟：
trypanblue（0.4%）與細胞培養液以1:1比例充分溷合，
1ml/well加入培養皿，靜置30分鐘后以PBS清洗至乾
淨，顯微鏡檢查其染色狀況。
二、定量：
MTTassay:
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A.原理：
藥物處理過的細胞，其存活率（cellviability）可以MTT
還原法評估。健康細胞可產生較多之能量供細胞代謝粒腺
體內的琥珀酸去氫酶(succinatedehydrogenase)能將MTT
3,(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)
bromide)由黃色還原為紫色之formazan結晶顆粒，而還原
力的強弱，即可代表琥珀酸去氫酶之活性，也就是代表代
表細胞之生理狀況以及存活率（Manthorpeetal.,1986）
。
2,5-diphenyl-tetrzolium
B.步驟：
藥物實驗后，將溶入0.1MPBS之MTT（5mg/ml）經
0.22µmfilter過濾，以1：9之比例加入細胞培養液，置
于培養箱中約
Isopropanol1000µl/well并反覆沖洗以便將結晶之MTT
完全溶解，取其溶解后之液體置入分光光度計中
（SHIMADZU，UV-1601，Japan）以波長570nm測定
，
MTT反應的量。
另將培養皿置于倒立顯微鏡下觀察型態，藉由觀察細胞
型態的變化，瞭解細胞受損的情形。正常健康的神經元細
胞會呈現平滑之橢圓或圓的外型及直徑一致，外型平滑的
軸突。死亡的細胞外觀呈現細胞膜不完整，細胞萎縮、破
裂以及軸突斷裂的現象。
1小時后，將上層液體吸除，加入
第三節、資料之統計與分析
將實際測得之數值平均后，以平均值加減標準誤（Mean
±SE）為製作圖表之依據。并使用SigmaPlot套裝軟體，進行
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重複變數單因子變異數分析（One-wayANOVA）來分析各組